2013 年科學報告，CRISPR技術可以在生物真核細胞中，進行精準而有效的基因組編輯。 從那時起，這種方法像暴風雨般地吸引了科學界中成千上萬的實驗室，將它應用於從農業至生物醫藥。 然而，過去這20年的旅程 - 從發現了一個奇怪的微生物重複序列、後認為是適應性免疫系統、 其生物學特性、 並且對基因組工程的重新利用 -所知仍然很少。 本文是在回顧這段人類重要的創意和這群先驅者的故事。
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| CRISPR發展的科學接力的世界地圖 |
發現CRISPR
故事從西班牙的科斯塔布蘭卡的地中海聖波拉港口開始，美麗的海岸和廣闊的鹽沼，幾個世紀以來吸引了無數渡假客--紅鶴和鹽商。Francisco Mojicag生長於此，小時經常到海灘玩耍。所以毫不奇怪，當他1989年在阿利坎特大學開始了他的博士學位，他加入海岸附近專門研究Haloferax mediterranei的實驗室。Haloferax mediterranei是一種具有極端耐鹽的古老細菌微生物，從Santa Pola的沼澤中分離出來。他的老師發現生長介質的鹽濃度會影響限制酶切割微生物基因組的方式，Mojica於是開始收集會改變的基因片段表徵。在他檢查的第一個DNA片段中，發現一個奇特的結構 - 基因組中發現了大約30個鹼基對（bp）長度的回文重複序列，這些序列由36鹼基bp的間隔序列隔開，不同於任何家族的微生物已知的重複片段（Mojica等，1993）。
28歲的研究生Francisco Mojica將他往後10年的職業生涯，立意為揭開這神秘面紗。他很快就發現了與密切相關的H. volcanii 菌以及更遠的嗜鹽古菌都有類似的基因重複片段。查考文獻時，他也發現日本團隊的一篇論文（Ishino等，1987）也提到在大腸桿菌中與Haloferax的重複序列都具有相似結構，儘管序列不同。但這些作者幾乎都沒有觀察到，但是Mojica意識到在這樣遙遠的微生物中存在這種相似的結構，必定在原核生物中有其重要功能。他發表了一份新分類的重複序列的論文 （Mojica等人，1995年）之後，他到牛津大學攻讀博士後研究。
Mojica 後回到阿利坎特大學擔任教職。因為學校沒有資金或實驗室空間，他轉向生物信息學來調查這奇怪的重複序列，將它稱為short regularly spaced repeats （SRSRs），根據他的建議，這個名字後來改成"群聚且有規律間隔的短回文重複序列"(clustered regularly interspaced palindromic repeats)簡稱CRISPR （Jansen等，2002; Mojica和Garrett，2012）。
到了2000年，Mojica在20種不同的微生物中發現CRISPR基因座，包括結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis，艱難梭菌 (Clostridium difficile)和造成瘟疫的耶爾西菌鼠疫菌the plague bacteria Yersinia pestis（Mojica等，2000）。 在2年內，研究人員將微生物普查翻了一番，並對位點的主要特徵進行了編目，包括臨近附近特定的CRISPR相關基因（cas），推測這可能與其功能相關（Jansen等，2002）。 假設有很多：參與基因調控、複製子分配對，DNA修復和其他角色（Mojica和Garrett，2012）。 但是大多數都止於猜測，很少或根本沒有證據，後來一個接一個的猜測，都證明是錯誤的。 與CRISPR的發現一樣，關鍵的見解來自生物信息學。
（表1總結了CRISPR系統的現代分類）。但CRISPR系統的功能是什麼？
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圖2.來自嗜熱鏈球菌的II類II型CRISPR-Cas9系統
II型系統是三種類型的CRISPR系統中最簡單的，並且是基因組編輯技術的基礎。
（A）該位點含有CRISPR陣列，四個蛋白質 -編碼基因（cas9，cas1，cas2和cns2）和tracrRNA。 CRISPR陣列包含重複區域（黑色菱形）源自噬菌體和其他侵入遺傳元件的間隔區（彩色矩形）所分隔的。 cas9基因編碼核酸酶(nuclease )，其通過切割與現有間隔物相匹配的入侵的DNA來賦予免疫力，而cas1，cas2和cns2基因編碼的蛋白質功能是從入侵DNA中獲得新間隔區。
（B）CRISPR陣列和tracrRNA被轉錄，產生長的一條前crRNA和一條tracrRNA。
（C）這兩種RNA通過互補序列雜交，並被Cas9和RNase III處理成較短的形式。
（D）所得複合物（Cas9 + tracrRNA + crRNA）開始搜索與間隔序列匹配的DNA序列（以紅色顯示）。與靶位點的結合也需要原始相鄰基序（PAM :protospacer adjacent motif ）的存在，其功能是作為Cas9的分子手柄來抓住標靶RNA。
（E）一旦結合到，當crRNA和標靶DNA相匹配，Cas9結合到靶位點，就會在PAM位點上游三個鹼基上切割DNA。
Cas9含有兩個內切核酸酶結構域，HNH和RuvC分別是標靶DNA的互補與非互補鏈，用於切開標靶DNA，產生鈍端。
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CRISPR是一種適應性免疫系統
在2003年的8月假期，Mojica為逃離 Santa Pola海灘的炎熱，跑到阿利坎特有空調的辦公室避難。至此，CRISPR新興領域的領導者已把重點從重複序列，放在被分開的間隔物。利用Mojica的文字處理器，Mojica精心提取每個間隔物，並將其插入到BLAST(The Basic Local Alignment Search Too) 程式中，以搜索這些間隔物是否與其他已知DNA的序列相似。他過去也嘗試過，但沒有成功。後來DNA序列數據庫不斷地擴大，這次他終於掘到了黃金。在他從大腸桿菌菌株測序的CRISPR基因座中，其中一個間隔物與感染過許多大腸桿菌菌株的P1噬菌體的序列相同。而且有攜帶間隔物(spacer)的特定菌株對P1噬菌體感染具有抗性。到了週末，他已經艱苦檢索了4500個CRISPR spacers。在與已知序列相似的88個間隔，三分之二攜帶間隔物的微生物與病毒或染色體外的一小段遺傳共軛質體(conjugative plasmids)相同。 Mojica意識到， CRISPR基因位點儲存了用於為保護微生物抵抗感染的適應性免疫系統所需的信息
Mojica出去與同事們喝白蘭地 (cognac)慶祝，第二天早上回來起草一份投稿文件。於是開始了為期18個月的挫敗感。 Mojica 認知到發現的重要性，將論文投給自然 (Nature)期刊 。 2003年11月，自然期刊拒絕了該論文的發表，沒有外部審閱，不可思議的是，編輯宣稱，關鍵的想法是已知的。 2004年1月，“國家科學院院報”(the National Acad-emy of Sciences)決定，該論文缺乏足夠的"創新性"(novelty)和“重要性”，以證明它有送出審查。Molecular Microbiology 與 Nucleic Acid Research 等期刊依次拒絕該論文。 Mojica處於絕望而害怕被搶先，後來將論文發送到“分子進化雜誌”(Journal of Molecular Evolution)。經過12個月的審查和修訂，CRISPR可能的功能 論文終於在2005年2月1日刊出（Mojica et al。2005）。
大約在同一時間，CRISPR也在一個相當不太可能的地方受到關注：法國國防部，座落於在巴黎以南約30英里的一個單位。曾在巴斯德研究所訓練的人類遺傳學家Gilles Vergnaud 從Ge'ne'lale de l'Armement 獲得博士和博士後研究。 1987年完成學業後，他加入政府機構設立了第一個分子生物學實驗室。過來10年，Vergnaud持續他的人類遺傳學工作。但是，當20世紀的90年代後期，報導了，引起人們擔心在伊拉克的政權薩達姆·海珊正開發生物武器，法國國防部在1997年要求 Vergnaud 團隊把重點轉移到法醫微生物研究方法上，以菌株之間基因些微差異，追溯病原體。同時與巴黎大學附近的遺傳與微生物研究所建立聯合實驗室，他開始使用串聯重複多態性 (tandem-repeat polymorphisms)- 這是人類法醫DNA指紋圖譜的主要工具 -用來描述炭疽病和瘟疫的細菌菌株特性。
1964-1966年，越南暴發瘟疫，法國國防部獲得了獨特的61種鼠疫細菌樣本。 Vergnaud發現這些接近相關的分離物在其串聯重複基因座中是相同的 - 除了他的同事Christine Pourcel發現的位點CRISPR基因座不同外。這些菌株偶爾會因為存在新的間隔物(spacer)而不同，這些新的間隔物總是以偏振方式在CRISPR基因座的“前端”（Pourcel等人，2005）。令人矚目的是，許多新的間隔物是來自鼠疫耶爾森氏菌基因組中存在的原噬菌體(病毒)。作者提出，CRISPR基因座服務於防禦機制 - 正如他們的詩意說法，“CRISPR可能代表一個“過去的遺傳侵略”記憶。“Vergnaud發表他們的努力成果與Mojica 遇到相同的阻力。該論文被Proceedings of the National Academy of Sciences, Journal of Bacteriology, Nucleic Acids Research, and Genome Research 等期刊所拒絕，2005年3月1日 最終發表在微生物學期刊上( Microbiology) 。
最後，作為法國國家農業研究所的微生物學家的俄羅斯“移民”，是第三位研究發現者Alexander Bolotin也在2005年9月也在( Microbiology發表了一篇文章，介紹CRISPR的染色體外起源（Bolotin等， 2005）。他的報告實際上是在Mojica 2005年2月的論文一個月之後提交 – 也是被另一本醫學雜誌所拒絕。值得注意的是，Bolotin是第一個推測CRISPR如何賦予細菌免疫力的人 - 提出來自CRISPR基因座的轉錄是通過反義RNA來抑制噬菌體基因表現，猜測合理，證明卻是錯的。
CRISPR 適應性免疫的實證並用核酸酶
如Mojica一樣，Philippe Horvath在沒有選擇下，只好接受本土或不感興趣的論文題目。作為在斯特拉斯堡大學的博士生，他專注於用於生產酸菜的乳酸菌的遺傳學，這是阿爾薩斯特色菜色的中心
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鑑於他對食品科學的興趣，Horvath跳過了博士後研究，並於2000年末加入了位於法國西部Dange'Saint-Romain的細菌啟動文化製造商Rhodia Food，成立了第一個分子生物學實驗室。該公司後來被丹麥公司Danisco收購，又在2011年被杜邦收購。
Rhodia Food對Horvath的微生物技能感興趣，因為其他乳酸菌，如嗜熱鏈球菌，用於製造乳製品，如酸奶和奶酪。 Horvath的使命包括開發DNA的方法，用於精確鑑定細菌株並克服頻繁的噬菌體感染，這困擾著用於乳製品發酵的食品工業。了解某些嗜熱鏈球菌菌株，如何保護自身免受噬菌體攻擊，有著科學興趣和經濟的重要性。
在2002年底，荷蘭乳酸菌會議上了解CRISPR後，Horvath開始使用它來對其菌株進行基因分型。到2004年底，他注意到隔離物和噬菌體抗性之間有明顯的相關性 - 正如Mojica和Vergnaud在幾個月後所報導的內容。 2005年，Horvath及其同事 - 包括Rodolphe Barrangou，是在美國Danisco 一位剛出爐的博士和在Que' bec City大學的傑出的噬菌體生物學家Sylvain Moineau，開始直接測試CRISPR是否為一種適應性免疫系統。Moineau當時也是一名工業科學家。他在Laval得到食品科學博士學位，專研乳酸菌，在返回Laval的學術界之前，在聯合利華公司工作。自2000年以來一直與 Rhodia Food食品合作。
他們使用有良好表徵的噬菌體敏感嗜熱鏈球菌菌株(-sensitive S. thermophilus strain)和兩種噬菌體，這些研究者進行遺傳選擇，來分離噬菌體抗性的細菌。抗性菌株不攜帶經典的抗性突變（如噬菌體進入所需的細胞表面受體），而是在其CRISPR中獲得了噬菌體衍生的序列 （Barrangou等，2007）。此外，多個間隔物的插入會增加細菌對噬菌體的抗性。
他們觀察到後天獲得的免疫。他們還研究了兩種cas基因的作用：cas7和cas9。細菌需要cas7來獲得抗性，但攜帶噬菌體衍生的間隔物的那些細菌不需要該基因來保持其抗性，這表明Cas7只是參與產生新的間隔物並重複序列，但不是免疫本身。相比之下，cas9序列包含兩種類型的核酸酶基因序列 nuclease motifs, HNH和RuvC ），這核酸酶可能是用來切斷核酸（Bolotin等人，2005; Makarova等人，2006） - 用於對抗噬菌體是必需的工具; Cas9蛋白是細菌免疫系統的活性成分。
結論: 2007年 法國科學家Philippe Horvath和他的同事Rodolphe Barrangou以及Sylvain Moineau在研究生產酸奶的乳酸桿菌對噬菌體的抗性時，發現了Cas7和 Cas9蛋白在CRISPR中的作用：Cas7產生間隔和重複序列，Cas9則是核酸酶。
程序設計CRISPR
1989年，獲得博士學位的John van der Oost來自阿姆斯特丹自由大學，學術初始於使用藍細菌(cyanobacteria)生產的生物燃料來解決世界的清潔能源需求。他研究了細菌的代謝途徑，在赫爾辛基和海德堡工作，然後返回阿姆斯特丹。 1995年， Wageningen 大學給他一個永久的職位。 條件是希望他擴大一個從事極端微生物工作的小組。Van der Oost曾經在德國聽過有關Sulfolobus solfataricus，可存活在黃石國家公園的溫泉中，於是他去調查這些奇怪微生物的代謝途徑的進化差異。而後開始與美國國家衛生研究院國家生物技術信息中心（NCBI）的微生物進化與計算生物學專家尤金·庫寧（Eugene Koonin）合作。 Koonin已經著手分類和分析CRISPR系統。2005年Van der Oost來訪時，他將范德奧斯特（Van der Oost），帶入當時晦澀不明的CRISPR領域（Makarova等，2006）。
Van der Oost才剛獲得荷蘭國家科學基金會的大筆資金。除了用在自己的研究問題上，他還決定用一些資金來研究CRISPR。（在他5年後的報告中，他強調了該機構允許研究人員能自由轉移他們的科學計劃。）
他和他的同事將大腸桿菌CRISPR系統插入另一個缺乏自己內生系統的大腸桿菌株內。這讓他們可以描述其生化五種Cas蛋白複合物的特性，稱為Cascade（Brouns等人，2008）。 （大腸桿菌具有更複雜的屬第一類，第一型的CRISPR系統，其中Cas9的功能由Cascade複合物與核酸酶Cas3一起進行。見表格1。）
通過單獨移除每個組成分，顯示Cascade將從CRISPR基因座轉錄的一條長的前導RNA切割成61個核苷酸長的CRISPR RNA（crRNA）。他們選殖解序一系列與Cascade複合物共同純化的crRNA，發現全部以重複序列的最後8個鹼基開始，隨後接著完整的間隔區和下一個重複區域的開始。這一發現支持早先的建議，即重複序列的回文性質將形成crRNA的二級結構（Sorek等，2008）。
為了證明crRNA序列是負責CRISPR的對抗病毒的基礎，他們開始創建第一個人造CRISPR陣列，程序設計CRISPR來靶向λ（l）噬菌體中的四個必需基因。正如他們預測的那樣，攜帶新的CRISPR序列的菌株顯示出對噬菌體的抗性，這是第一例直接程序設計CRISPR的免疫- 一種針對細菌的流感疫苗。
結論
2008年8月 荷蘭科學家John van der Oost通過生物化學方法鑑定了一系列Cas蛋白，並發現這些蛋白需要切割一段長為61鹼基的前體RNA（crRNA）才能工作。他們證明了crRNA的作用，並通過人為設計相應的crRNA序列使菌株獲得了抵抗噬菌體的特性。這是人類首次編輯CRISPR系統。
CRISPR靶向DNA
Luciano Marraffini 在芝加哥大學攻讀Staphylo-coccus博士學位時，從Malcolm Casadaban ，一位嗜菌體遺傳學領域的權威，學得CRISPR。 Casa-daban在2005年立即看到了CRISPR發現的重要性，認為CRISPR很可能是一種適應性免疫系統。Marraffini 相信CRISPR不能通過RNA干擾來發揮作用，他認為這種機制太低效，無法克服噬菌體感染時發生時的爆炸性增長。相反，他推斷，CRISPR必須切斷DNA，就像限制酶作用一樣。
Marraffini渴望在CRISPR研究實驗室做博士後研究，為配合太太在芝加哥的工作。他說服，一直在研究RNA剪接和RNA干擾的西北大學的生物化學家Erik Sontheimer，讓他加入他的實驗室研究CRISPR。
他開始 探索Staphylococcus CRISPR系統是否可以阻止質粒共軛(plasmid conjugation)。他注意到，表皮葡萄球菌株具有與對抗生素有抗藥性的金黃色葡萄球菌質粒上編碼的切口酶（nes）基因區域相匹配的間隔區。這說明，這些質粒不能轉移到表皮葡萄球菌中，但破壞質粒中的nes序列或基因組中CRISPR基因座的匹配間隔序列會破壞干擾（Marraffini and Sontheimer，2008）。顯然，CRISPR阻斷了質粒，就像它阻止了病毒一樣。
Marraffini和Sontheimer試圖在體外重建CRISPR系統以證明它能切割DNA。但表皮葡萄球菌系統過於復雜 - 它有9個cas基因 - 並且無法將之特徵化。相反，他們轉向分子生物學。巧妙地，他們修改了CRISPR系統靶向的質粒中的nes基因 - 在其序列的中間插入一個自剪接內含子。如果CRISPR靶向mRNA，則該改變不會影響干擾，因為內含子序列將被剪接掉。如果CRISPR靶向DNA，插入將消除干擾，因為間隔區不再匹配。結果很清楚：CRISPR的目標是DNA。
Marraffini和Sontheimer認識到CRISPR本質上是一種可編程的限制酶。他們的論文首次明確預測CRISPR可能在異源系統中，可用於基因組編輯。 “他們宣稱”，從實際的角度來看，CRISPR任何有24至48個核苷酸的靶序列的DNA就有可尋址破壞的功能效用，特別可在原生細菌或古細菌環境。“他們甚至提交了一個包括使用CRISPR在真核細胞中切割或修正基因組位點的專利申請，但它缺乏足夠的實驗證明，最終放棄了（Son-theimer和Marraffini，2008）。
Reference :
Cell 164, January 14, 2016 ª2016 Elsevier Inc.
